一、目的要求
1.掌握从土壤中分离放线菌的方法。
2.综合练习无菌操作技术。
二、技能目标
能用稀释倒平皿法进行土壤中放线菌的分离。
三、试剂和器材
1.试剂：已灭菌的高氏Ⅰ号1瓶，90mL无菌水（带玻璃珠）1瓶，9mL无菌水6管，10%酚液，95%乙醇。
2.器材：无菌培养皿6套，1mL无菌移液管10支，土壤样品，天平，称量纸，药勺，试管架，玻璃铅笔。
四、操作步骤
1.取土壤
取表层以下10～20cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2.制备稀释液（无菌操作）
（1）制备土壤悬液：称土样10g，迅速倒入带玻璃珠的90mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-1的土壤悬液。
（2）稀释：用无菌移液管吸10-1的土壤悬液1mL，放入9mL无菌水中即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-2～10-8的稀释液。
注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
3.混菌法倒平板（无菌操作）
取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液冷却5～6滴，摇匀，静置片刻，然后分别用无菌移液管从两管中吸出1mL加入相应标号的无菌培养皿中，每个稀释度倒3个重复。然后将已融化冷却至50℃左右的高氏Ⅰ号培养基，在每个培养皿内各倒入15~20mL，摇匀，凝固，制成平板。
4.涂布法分离
将已融化的培养基倒入无菌培养皿，待平板冷却后，用无菌吸管依次分别吸取加入10%酚液的10-5、10-4两管稀释液0.1mL，加入高氏Ⅰ号培养基的平板时，每个稀释度3个重复。左手拿培养皿，并用拇指和食指将皿盖在火焰旁打开一缝，右手持无菌涂棒，于平板培养基表面将菌液自平板中央均匀向四周扩散。
5.培养
将接种好的平板倒置，即皿盖朝下放置，在28℃～30℃中恒温培养4～5d，观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。
五、提醒与技巧
1.一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。
2.在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，以减少稀释中的误差。
3.放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
附：土壤中放线菌的稀释分离技术实训报告
实训名称：土壤中放线菌的稀释分离技术
姓名学号
专业班级
实训地点实训日期
一、实训目的
二、实训原理
三、实训材料
四、实训步骤
五、实训结果及分析
六、问题与思考
1.在分离放线菌的过程中，为什么要加入10％苯酚？
2.试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。
