二、马媾疫
2.间接血球凝集反应本法是以绵羊红细胞为载体，将抗原吸附于红细胞上，再与相应抗体作用，阳性者则出现吸附有抗原的红细胞在抗体的作用下发生凝集。本反应已用于弓浆虫病、棘球蚴病和旋毛虫病的试验诊断。现介绍弓浆虫间接血球凝集反应（简称IHA或HA）。
2.1材料准备
2.1.1抗原制备：由人工感染弓浆虫的小白鼠采集腹水，收集于生理盐水中，以2500r/min离心15min，弃去上清液，在沉淀中加人10倍量蒸馏水，混匀，置4℃中过夜，再以10000r/min离心lh，取上清液，加等量的1.7％盐水，分装于小试管中。-20℃下保存备用。
2.1.2磷酸缓冲液（PBS）：分pH7.2和pH6.4两种。pH7.2的配方是：0.15mol/L的氯化钠液100ml，0.15mol/L的磷酸二氢钾液23.9ml和0.15mol/L的磷酸二钠溶液76ml混合而成。pH6.4的三液混合比是100：67.7：32.2。
2.1.3正常兔血清（NRS）和正常猪血清（NSS）：即取正常兔血清，加入绵羊红细胞以吸收去其正常凝集素，再以PBS液配成1％～3％的溶液，即NRS；正常猪血清则改用猪血清制备，方法相同。
2.1.4配制含1％鞣酸的PBS液。
2.2致敏绵羊红细胞的制作采集羊血，抗凝，加pH7.2的PBS，而后以2000r/min离心15min，取下沉的细胞层，再以上清液洗涤，离心，反复进行3次，最后以细胞沉淀加PBS配成2.5％的细胞悬液，再加人含1％鞣酸的PBS，使其中鞣酸量为1/10000或1/20000，37℃水浴中15min，取出，再离心沉淀，并以pH7.2的PBS液离心洗涤3～4次，洗去多余的鞣酸，再加pH7.2的PBS液，使成2.5％的鞣酸红细胞悬液。
以2.5％鞣酸羊红细胞悬液1份，抗原液1份和pH6.4的PBS液4份混合，摇匀，置室温中15min，加1％NRS液，而后离心洗涤2次，在沉压细胞中加入3％NSS液，使成2.5％的红细胞悬液，此即致敏羊红细胞悬液。
2.3试验操作取被检血清0.5ml置凝集试管中；加入2％NRS液或3％NSS液1.5ml，置56℃水浴中30min以灭能；加入未致敏的羊红细胞悬液2ml，放人4℃冰箱中过夜（吸取其对羊红细胞的非特异性凝集素）；离心沉淀，吸取其上清液，即为1：8的被检血清；将上清液做成1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256等系列稀释；加入致敏羊红细胞悬液0.05ml（1滴）；置4℃中，2h与24h各检查1次。
2.4结果判断将试管取出，观察。
++++红细胞均匀地铺于管底。
+++红细胞铺于管底，但边缘不整。
++红细胞成环状沉于管底，边缘可见小凝集块。
+红细胞于管底形成一小团，但边缘不光滑，有小凝块。
-红细胞于管底形成小圆团，光滑整齐。
1：64的稀释管出现++者，判断为阳性。
四、补体结合试验（CFT）
在传染病诊断中所采用的补体结合反应也广泛地应用于一些寄生虫病的诊断，由于设备和操作较复杂，故未能大面积地应用，但已被介绍应用于诊断锥虫病、焦虫病、边虫病、弓浆虫病、棘球蚴病和旋毛虫病。在应用时，除抗原的制备与传染病不同外，各项具体操作均与其相同。
1.锥虫病补体结合试验抗原的制备
1.1明胶缓冲液：以硼酸12.5g加到lmol/L NaOH溶液100ml和蒸馏水25ml中，待硼酸溶解后，补加蒸馏水使全量达1000ml，为第1液。另以蒸馏水250ml，加纯盐酸8.4ml，再补加蒸馏水达1000ml，为第2液。以第1液61.2ml和第2液63.8ml混合，加氯化钠3.2g，明胶0.1g和蒸馏水375ml，l00℃加热30min使明胶溶化，校正其pH到7.2～7.4，（此时如pH过高可加第2液，pH过低可加第1液），用滤纸或脱脂棉过滤，分装小瓶，以12l℃高压蒸气灭菌30min，最后pH为7.3～7.5，保存于冰箱中。
1.2抗原制备：取在小白鼠继代的伊氏锥虫接种于犬腹腔中，一般在5～7d后，由犬耳静脉采血检查，当在600倍镜下每视野中的虫体数达100条以上时，即可用无菌手术全身放血，按1份血液加2份2％柠檬酸钠生理盐水抗凝。将此血以纱布过滤，离心分离后，取红细胞层表面的白色虫膜混悬于生理盐水中，再离心、再分离，如此反复洗涤，最后可得洁白的锥虫团块，将其按1：9比例加入明胶缓冲液后，倒人中性硬质振荡瓶中，在10℃温度下振荡48～72h，再离心分离，则上层液呈乳浊状，其浊度应相当于McFarland比浊管的第1号或第2号。吸取乳浊液，测定其效价，加中性纯甘油等量，分装于中性安瓿中，在低温冰箱中冻结保存，即为抗原，其效价应在120～200倍。保存期不少于30个月。
在进行补体结合试验时，将抗原稀释到两个单位，每管抗原用量是0.5ml。
2.棘球蚴病补体结合抗原的制备与皮内反应抗原制法相同。
3.弓浆虫病补体结合抗原的制备可将弓浆虫接种于鸡胚或小白鼠后采集虫体，以反复冻融处理，而后以超声波破坏之，取上清液为抗原。旋毛虫则用肌肉中的幼虫，分离后，制成生理盐水浸液或酸溶性部分做抗原。
在某些动物（如家禽和猪），血清中的抗体与相应的抗原相结合后，不但不能固定补体，而且还能抑制另一些动物的已知免疫血清与该相应抗原结合补体的能力，因此，以后再加溶血系统，如出现溶血则为阳性反应，而不溶血则为阴性反应，即所谓补体结合抑制试验。家禽的某些疾病和猪的弓浆虫病诊断多采用补体结合抑制试验。
五、荧光抗体试验
荧光抗体技术在免疫血清诊断上已广泛应用。常用的有直接荧光抗体法和间接荧光抗体法，此外还有荧光抗补体法和可溶性抗原荧光抗体法等。
1.直接荧光抗体法本法是以已知抗体与荧光色素相结合。当待检病料中怀疑含有相应病原时，可将病料用此荧光抗体处理。如病料中有该病原，则将与荧光抗体相结合。以此结合后的病料在荧光显微镜下检查，即可见有闪光的病原存在。
本法多用于显示病料中是否含有某种病原体，特别是那些在显微镜下形态上不易肯定的病原体，如用于弓浆虫、边虫、肌肉中变了形的旋毛虫等。
2.间接荧光抗体法在此法中，抗体在整个反应中除与抗原结合起抗体的作用外，又将抗体分子本身作为抗原，注射到另一动物体内，形成抗抗体。将抗抗体与荧光色素相结合。以已知的病原作成抹片与未知的可疑患畜血清相作用。如该畜是病畜，有抗体存在，则该抗体即与病原结合，并附着在载玻片上，再用荧光抗抗体处理，玻片上即出现荧光。反之，健畜没有抗体存在，玻片上的已知病原不被抗体结合，则抗抗体也不可能结合在载玻片上。
2.1猪弓浆虫病的间接荧光抗体诊断法
2.1.1抗原制备：取人工感染弓浆虫的小白鼠腹水，反复以生理盐水洗涤，除去虫体以外的杂质，最后取虫体沉淀，加pH7.2的PBS液（配法见间接细胞凝集反应），并加福尔马林，使福尔马林在其中的浓度为l％，置室温中30min固定；再以生理盐水用离心法洗涤，最后将沉淀滴于载玻片上，37℃中lh，待干，保存于-20℃冰箱内，即为抗原涂片，保存期4个月。
2.1.2抗猪血清荧光抗体（荧光抗抗体）的制备：采猪血清，用硫酸铵沉淀法提取猪的IgG。以所得IgG加弗氏佐剂（Freund‘s，adjuvant，其制备方法是以液体石蜡9份，羊毛脂1份，加1％的吐温80，加热溶解后，高压灭菌。临用时，在每毫升中加入卡介苗1～2mg），混合后给兔高度免疫，得含抗猪血清抗体的兔血清；再将兔血清以柱析法提取其IgG。以1：20v/w的异硫氰酸荧光黄（F1TC）与IgG结合，结合后透析5d，再以小白鼠肝粉吸附，以除去其中非特异性因素。
2.1.3操作方法：当欲测定某猪是否已被弓浆虫感染而产生弓浆虫抗体时，采该猪血液，分离血清、并做序列稀释。
将已制备的含有弓浆虫虫体的抗原涂片，滴加稀释的被检血清，在37℃水浴上作用40min，而后将涂片置pH7.2的磷酸盐缓冲液中7min，漂洗2次，取出玻片，再滴加抗猪血清荧光抗体，37℃温箱中20min，再加pH7.2的磷酸盐缓冲液，在其中放7min，漂洗2次，而后加9份甘油和1份磷酸盐缓冲液的混合液1滴，封加盖玻片，在400倍荧光显微镜下检查。
2.1.4判定标准：荧光显微镜下检查时的判定标准是：
-没有发现染有荧光的弓浆虫体。
±弓浆虫体上现有微弱荧光。
+弓浆虫体上现有明亮荧光。
++全部虫体上发荧光。
2.2血吸虫病的间接荧光抗体诊断法以成虫或尾蚴制作抗原，如以成虫制作抗原，则以新采取的雄成虫，用甲基纤维素包埋后冰冻，切成4～6um厚度的冰冻切片，充分干燥，以丙酮固定10min。如以尾蚴制作抗原，则在载玻片上先涂一薄层鸡蛋蛋白，充分干燥，再涂上新鲜尾蚴20～30条，干后，以95％酒精室温中固定5min。
取以上任一种抗原玻片，滴加被检血清，置密闭湿盒内37℃作用45min，在磷酸缓冲液中洗3次，每次15min，吹干，再加以FITC标记的兔抗牛血清1滴，再置密闭湿盒内37％作用45min，取出用磷酸盐缓冲液洗3次，吹干；用3％伊文思蓝（Evans blue）对比染色，丙酮脱色，滴加9份甘油与1份磷酸盐缓冲液混合成的包埋剂，加盖玻片荧光显微镜下检查。
六、其他免疫血清试验
用于寄生虫病的免疫血清学反应有多种，如弓浆虫病所特用的染料试验、中和试验、对流免疫电泳、白细胞游走抑制试验、酶标记免疫吸附试验、幼虫活动抑制试验等等。但其中多数只作为一种研究工作的手段，用于诊断疾病的只有弓浆虫病所特用的染料试验（即弓浆虫染料试验），兹介绍如下：
1.抗原制作采集人工接种弓浆虫小白鼠72h后的腹水，加生理盐水，反复离心洗涤2—3次，最后以生理盐水混悬，使每毫升混悬液中含弓浆虫约500万个（即取1滴于玻片上，600倍显微镜下每视野有虫体30～40个）。
2.补助因子取健康人血清（应不含弓浆虫抗体），预检其对着色影响不超过10％。
3.染液以美蓝在95％酒精中的饱和溶液（约为1.48％）1份，加pH1l的缓冲液9份混合。Ph ll的缓冲液是用0.53％的碳酸钠溶液97.3ml，加1.91％的硼砂（Na2B4O7.10H2O）溶液2.7rnl。
4.操作取被检动物血清，置56℃水浴中30min灭能。用生理盐水做1：2、
1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128等稀释，而后各取0.1ml，加补助因子0.2ml，再加抗原0.1ml，置37℃温箱中12h，取出待冷，加美蓝染液2～4滴，振荡5—6min后取出检查。
在以上操作的同时，应另作三种对照：
对照①：生理盐水0.1lml+补助因子0.2ml+抗原+美蓝染液。
对照②：生理盐水0.1ml+抗原+美蓝染液。
对照③：生理盐水0.1ml+补助因子0.2ml+已知阳性血清+抗原十美蓝染液。
检查时，在400倍显微镜下观察，其中虫体50％以上不被染色者为阳性指标。对照①应全部着色。对照②应90％以上着色。对照③应全部不着色。
猪的判断指标：当1：16～32呈阳性时为可疑；1：64为阳性时判断该猪为已受感染。
