6.50％聚乙二醇（PEG）溶液取约3gPEG（MWl520或4000）放人试管中，加盖包有硫酸纸的棉塞，121℃0.069—0.075MPa，高压灭菌10min。当融化的PEG温度降至41℃左右时，加入等量的1640基础培养液（已预热至41℃左右，并用7.5％NaHC03调pH至8.2），用温热的吸管吹吸混拌均匀，按0.8ml/支分装在安瓿中，放-20℃冻存备用。
7.7.5％NaHCO3溶液取7.5gNaHC03溶于100ml三蒸水中，0.22um膜滤除菌，分装小瓶中，4℃保存。
8.氨基喋呤（A）贮存液取1.76mlA，加90ml三蒸水，滴加0.05mlNaOH助溶，待完全溶解后，加0.5ml lmol/L HCL中和，补足100ml三蒸水，0.22/um膜滤除菌，分装4ml/瓶，－20℃保存。
9.次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液取136.1ml H和388ml T，加45～50℃三蒸水至100ml，使之溶解，0.22um膜滤除菌，分装4ml/瓶，-20℃保存。
10.HT培养液在完全培养液中按1％加HT贮存液。
11.HAT培养液在完全培养液中分别按1％加A贮存液和HT贮存液。
12.8-氮鸟嘌呤贮存液取200ml 8-氮鸟嘌呤加入lml lmol/L NaOH中，溶解后加三蒸水至100ml，0.22um膜滤除菌，按4ml/瓶分装，-20℃保存。
13.8-氮鸟嘌呤培养液向全培养液中按1％加入8-氮鸟嘌呤，即为含20ug/ml的全培养液。
五、操作方法
1.抗原制备选用什么形式的抗原免疫动物？选用什么形式的抗原作筛检抗原？这是研制单抗设计中需要着重考虑的策略。一般来说，免疫抗原越纯，杂交瘤细胞的阳性率越高。某些抗原甚至不提纯，杂交瘤细胞也有相当高的阳性率。应根据研究对象的具体情况和研究目的而定。研制病毒特异性单抗往往经密度梯度离心或层析纯化过的病毒作免疫抗原和筛检抗原。但用粗提或不提纯的病毒抗原免疫动物也能获得成功。如以新城疫病毒浓缩尿囊液或疫苗、马立克氏病毒感染细胞的超声波粉碎抗原、口蹄疫病毒和猪水泡病病毒聚乙二醇或硫酸铵浓缩抗原作免疫抗原、进行杂交瘤试验，均曾获得成功。研制细菌单抗往往用全菌或其裂解物作免疫抗原。研制抗原特定表位的单抗时需精心设计技术路线。如研制羊布氏菌疫苗弱毒菌株特有抗原成分单抗，先分析强弱菌株各种抗原成分，找出抗原，然后通过亲和层析法分离纯化抗原用于免疫和筛检。但是，研制不同型口蹄疫病毒12s抗原的群特异性单抗时，就不采取先分离群特异性抗原的技术路线，而是用一个型（A型）口蹄疫病毒12s抗原作免疫抗原，用另一个型（O型）口蹄疫病毒12s抗原作筛检抗原，获得成功。免疫抗原用鼠组织毒制备，不必精提，因为鼠源杂蛋白与Balb/c动物是同种，应属弱抗原，显然，后者的技术路线比前者的简便得多。
2.免疫免疫的目的是为了获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，并使B细胞在抗原刺激下分化，易于细胞融合，通常选用与骨髓瘤细胞系同系动物进行免疫。如用动物骨髓瘤细胞系，则选用2～3月龄的Balb/c动物；如用大鼠骨髓瘤细胞系则选用Lou/c大鼠。采用什么样的免疫程序取决于具体抗原性状和免疫对象以及要制备什么样性质的单抗而定。但在多数情况下都是参照制备抗血清的常规免疫方法。基础免疫，如病毒抗原，多用福氏腹腔注射无佐剂抗原。一般认为，最后加强免疫采用静脉途径比腹腔好。具体方法：如制备口蹄疫病毒单抗，用福氏完全佐剂抗原，腹腔接种于Balb/c动物，每只20～30ug抗原，4～6周后用同样剂量的无佐剂抗原静脉注射，之后第三天取脾融合。用活毒免疫，方法简便，易获得IgM类中和单抗。如研制口蹄疫病毒单抗时所采用的活毒免疫法为：100LD50的O型口蹄疫病毒活毒，用适当剂量（接种待免疫的同龄动物至致死率为10％左右），腹腔接种90日龄Balb/c动物，之后第7天融合，可获得高滴度IgM类中和单抗。
此外，也有用其他动物的免疫脾细胞与动物骨髓瘤细胞融合，制备异源杂交瘤，生产非鼠源单抗。但这种杂交瘤不够稳定，染色体易丢失。在免疫方法上，还有把抗原直接注入脾内或取外周血淋巴细胞在体外培养中免疫。用这种免疫方法，3天后即可融合。对于来源困难、免疫原性差或对机体有害的抗原可用体外免疫。体外免疫的具体操作方法为：取脾细胞或外周血淋巴细胞制成单细胞悬液，用无血清培养液洗2～3次，然后悬浮于含10％小牛血清的全培养液中，加适量抗原（可溶性抗原一般为0.5～5.0ug/ml细胞抗原为105～106个/m1），在37℃，5％～7％CO2箱中培养3～5d，即融合。
3.融合和选择性培养
3.1饲养细胞的制备：在HAT培养液中加入饲养细胞可促进融合后杂交瘤细胞的生长。动物腹腔巨噬细胞、正常脾细胞、胸腺细胞均可作为饲养细胞。由于腹腔巨噬细胞清除死亡的能力强，制备方便，故最为常用。具体操作是：在融合前1～2d，取Balb/c动物3～4只，拉颈致死，浸入75％酒精中消毒体表，然后用大头针固定在蜡板上，在无菌条件下小心将腹部皮肤剪一小口（切勿剪破腹膜！），剥离皮肤，暴露腹膜，用10ml注射器将5～7ml预冷的无血清培养液注入腹腔，不拔针头，用弯头镊子夹住针眼处的腹膜，固定针头，封住针口，用另一弯头镊子挤压、揉动腹部约lmin，然后吸出注入液体，加入冰浴冷却的50ml尖底塑料离心管中，1000r/min，离心5～10min，弃上清，用10ml无血清基础培养液重悬定容，计数细胞。根据需要留取适量细胞悬液，离心弃上清，用HAT培养液重悬，使细胞浓度为每毫升105～2×105个，加到96孔板中，每孔0.1ml，置37℃CO2培养箱中待用。也可以在融合当天制备饲养细胞，加入HAT培养液中与融合细胞混合物一起分种于细胞板中。活细胞计数方法为：取0.1ml细胞悬液，加0.9m10.4％台盼蓝染液混匀，用血球计数板计数。死细胞为蓝色，活细胞不着色。镜检时，计数板四角大格内细胞数，压线者只计上线和右线细胞。
3.2骨髓瘤细胞的培养：维持动物骨髓瘤细胞于最佳生长状态是融合成功的因素之一。这种细胞倍增时间一般为10～16h，在融合前一周内使其保持对数生长期。刚复苏的细胞需2周时间才能达到适于融合状态。融合时需收集2×107个以上骨髓瘤细胞。具体操作为：将细胞培养瓶中液体吸出（或倒出），加人适量无血清基础培养液，用弯头吸管将细胞从瓶壁吹洗下来，用尖底塑料离心管收集细胞悬液，离心沉淀，弃上清，加入10ml无血清培养液重悬，进行活细胞计数。活细胞数应在90％。
为防止在传代过程中部分骨髓瘤细胞返祖，可用含15～20g/ml 8-氮鸟嘌呤的完全培养液定期处理骨髓瘤细胞，使其对HAT呈均一敏感性。
3.3免疫脾细胞的制备：取加强免疫后3d的Balb/c动物1～2只，先眶下窦采血，供测抗体用，然后拉颈致死，浸入75％酒精中体表消毒，无菌剥离腹部皮肤，剪开腹膜，取脾，去脂肪和结缔组织，放人约含5ml无血清培养液的平皿中的铜网上，用弯头镊子挤压研磨，使细胞分散在液体中，弃渣，离心沉淀，弃上清，加入10ml无血清培养液重悬，按上述方法计数活细胞。
4细胞融合操作程序
4.1融合
4.1.1按骨髓瘤细胞与脾细胞1：5的比例取两种细胞。一般取约2×107个骨髓瘤细胞和108个脾细胞加入50ml尖底塑料离心管中，混匀；
4.1.2以1000r/min离心10min，弃上清，倒置灭菌滤纸上吸几次管口残液，然后用手指弹击管底，使沉淀细胞团成松散状，置37℃水杯中预热；
4.1.3用lml吸管取0.7ml已在37℃温箱中预热的50％PEG（pH8.0）缓缓滴入含混合细胞的离心管中，边滴边摇动（离心管不离开水面），60s内滴完，然后在水中静置90s；
4.1.4用20ml注射器取15ml预热的无血清培养液，在2min内向融合管内滴完。开始时慢加，lmin后加快，直至滴完。再补加15ml无血清培养液；
4.1.5以1000r/min，离心10min，弃上清，加入40ml含20％小牛血清HAT全培养液，轻轻吹吸几次，分散细胞，用弯头滴管分装于含饲养细胞的4块96孔板中，每孔0.1ml，盖盖，用胶纸（布）固定；
4.1.6将培养板置37℃，5％～7％CO2温箱中培养。
4.5选择性培养：
4.2.1融合后用HAT全培养液培养7d后，用HT全培养液对培养板中液体进行半量换液；
4.2.2融合3d后开始镜检，观察是否融合成功，不必天天镜检；
4.2.3融合后7天左右，逐孔镜检，标出每孔细胞群总数。
4.2.4当细胞群落已超过显微镜1/2视野大时（约培养10d左右），取上清液供抗体检测，同时补加HT培养液。去掉A液后，细胞将恢复叶酸代谢途径。
5.杂交瘤细胞的筛选融合后10d左右，如前所述采集待检样品，进行杂交瘤细胞的筛选。由于在一天内要报告几百个样品的检测结果，且由于细胞上清液中抗体含量低微，且过度生长的细胞转移时成活率低，所以应采用快速、敏感、准确、稳定的筛检方法。以下简单介绍抗体检测技术的操作程序。
5.1酶联免疫吸附试验（ELISA）：该法在杂交瘤细胞的筛选和单抗的鉴定中最为常用。根据反应方式不同，可将其分为以下四类：
5.1.1羊抗鼠或兔抗鼠双抗体夹心ELISA：能识别所有鼠源抗体。凡是分泌鼠源抗体的杂交瘤细胞均可被筛选出来，然后再通过间接ELISA或捕获ELISA或其他特异性检测方法确定目的杂交瘤细胞。如果通过一次融合企图获取不同特异性的两种或两种以上的单抗，或在筛检抗原制备困难而数量有了的情况下研制单抗时，均可采用此法先作初筛，缩小范围，待进一步特异性筛检。
5.1.2间接ELISA和捕获ELISA：能识别与抗原相对应的特异性抗体。一般用于分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选和单抗特异性鉴定。其中捕获ELISA，由于首先用多抗致敏酶标反应板、增强板对抗原的结合能力，因此一般来说它比间接ELISA更稳定和敏感。
5.1.3液相ELSA：由于抗原和抗体在液相中反应，可以保持自然构型，所有表位处于完好状态，并可与抗体进行全方位反应，其结果与中和反应较为一致，适于中和性单抗的筛选和病毒抗原表位分析。
在进行ELISA试验时，每块酶标板应设阴性和阳性对照。阴性对照可用骨髓瘤细胞上清或其腹水，或用其他单抗上清液或腹水；阳性对照用已建立的杂交瘤细胞上清或其腹水，或免疫动物多抗血清。结果常以P/’N≥2.1，或P≥N+3SD公式判定阳性。P代表阳性孔OD值，N代表一组阴性对照孔OD值的平均值，SD代表阴性对照标准差。因细胞上清样品单抗含量低微，检测时不作稀释。
5.2免疫酶组化法：主要用于检测针对细胞抗原成分或细胞上病毒抗原成分的单抗。常用间接免疫过氧化物酶试验（IIP）或碱性磷酸酶一抗碱性磷酸酶桥联标技术（APAAP），镜检判定结果。
5.3免疫荧光技术：与免疫组化法相似，主要用于各种细胞抗原成分和感染细胞中病毒抗原成分的检测，具有操作简便、敏感，可对抗原成分直观定位等优点，常用于单抗的筛选和鉴定。凡检测针对细胞内成分的单抗，将细胞片经-20℃冷丙酮固定后作荧光染色；而检测针对细胞内成分的单抗，则用活细胞作膜荧光染色。
5.4放射免疫测定：在筛选和鉴定单抗时常用固相抗原法，其反应原理与ELISA相似，所不同的是用放射性同位素养（如125I）标记的羊或兔抗鼠抗体代替酶标抗体作指示系统。由于同位素半衰期的限制，操作规程同位素污染对人的危害以及废物处理的困难，一般实验室很少采用。
5.5间接血凝试验（IHA）：该法快速、简便、较为敏感、影响因素不易掌握，也常应用于单抗的筛检。但因敏感性和反应范围的限制，不如ELISA应用广。
6.杂交瘤细胞的克隆化融合后必须对阳性孔中杂交瘤细胞进行克隆化，其原因是：融合后阳性孔中的杂交瘤细胞不一定都是目的细胞；一些杂交瘤细胞是不稳定的，可能丢失染色体，丧失产生抗体能力，需不断清除变异细胞；在液氮中长期保存的杂交瘤细胞也有丧失分泌抗体的可能。所有这些情况说明，需对杂交瘤细胞进行连续克隆化，以纯化目的细胞。
最常用的克隆化方法是有限稀释法，操作步骤如下：
6.1提前1～2d向96孔板加动物腹腔巨噬细胞，置CO2培养箱中备用，方法见细胞融合操作程序；
