公元前333年8月末，亚历山大入境西里西亚，使波斯帝国失去了在小亚细亚的最后一片属地。这下可牵动了大流士三世的敏感神经。在波斯贵族频频请缨与亚历山大决一雌雄的情势下，这位登基仅三年的皇帝只得紧急调兵遣将。之后，他率领大军离开首都苏萨，经巴比伦，在9月初抵达阿曼山脉东边的索廓依。索廓依向东接壤两河平原，对于大流士庞大的军队很具优势，相较之下，亚历山大因为在军队人数上处于劣势，反而不适应在平原地带与大流士对抗。
就在大流士等待亚历山大前来决战时，亚历山大却在西里西亚病倒了。风寒症令他卧床一月有余，这可急坏了大流士。由于交通阻塞，大流士不知道亚历山大逗留西里西亚的真正原因。最终，大流士决定掌握主动权，兵发西里西亚寻找亚历山大。但同时，他派出3万人马加固防守叙利亚的大马士革，这样，一旦亚历山大南下侵犯，这支军队便可挡住马其顿军队对于腓尼基首府提罗城的觊觎，更可与北面的大流士部队形成合围亚历山大之势。
果然不出大流士所料，亚历山大在生病期间就已派出帕门尼奥引领人马南下占领叙利亚隘口，并密切探听大流士的动向。当他接到波斯军队即将离开索廓依的密报时，他立即想到大流士一定会从叙利亚隘口通过。于是，这一年10月底，病愈的亚历山大率军离开伊苏斯，直扑叙利亚隘口。这一次，亚历山大的决定被大流士识破了。他料定亚历山大定会南下与帕门尼奥军会合，于是避实就虚，北上阿曼隘口。不费吹灰之力，波斯军队进入伊苏斯的马其顿营地，从亚历山大背后切断了他的后勤供给线，这样迫使他不得不在军队断粮前及时赶回伊苏斯。
可能是天助亚历山大，此时的大流士突然南下到皮纳鲁斯河谷驻扎。这里夹在山与海之间，皮纳鲁斯河拦腰穿过，波斯军队被地形强迫化整为零，骑兵则失去用武之地。不过，这种地形对于人数上不占优势的马其顿军队反而十分有利。虽然大流士自认为南迁的举动，意在以强势兵力进一步威逼亚历山大不要再作困兽之斗，但他还不清楚他的对手是个越挫越勇的人。所以当马其顿军队渐渐逼近时，大流士显得大为惊讶，他的部队也明显疏于防范。情急之下，大流士赶忙派出3万骑兵过河抵挡敌军。
双方对峙，亚历山大发现己方左翼相对波斯那边过于单薄，于是，他当即命令右翼的贴撒利重骑兵悄悄潜至左翼隐藏于方阵后面。之后，亚历山大派人攻下波斯步兵据守的右侧山坡，以使马其顿侧翼不被攻击。一切准备就绪，亚历山大亲率近卫骑兵冲向敌军左翼。波斯纵有玛底亚神箭手那如暴风骤雨的箭矢，亚历山大和他的近卫骑兵仍然快速过河冲到波斯左翼阵前。这时候，抗冲击力极差的弓箭手们四散奔逃，慌乱中与其后面的加尔达刻步兵方阵互相冲撞，自乱了阵脚。不多时，亚历山大的右翼部队加入战团，虽然加尔达刻步兵方阵人多势众，一度将马其顿骑兵夹在中间不得活动，但马其顿方面的步兵骑兵联合进攻的战术，以及步兵们短兵相接的强劲实力，令加尔达刻步兵方阵吃尽了苦头。很快，波斯左翼阵线失陷。
就在亚历山大左翼发动进攻时，波斯右翼骑兵统帅纳巴乍尼一声令下，几千波斯铁甲骑兵排山倒海般向马其顿左翼袭来。他们首先攻破希腊联盟重骑兵的防线，继而对马其顿左翼形成包抄之势。正在这时，早已埋伏好的那1800名贴撒利重骑兵突然冲出，将敌军赶到河对岸，并且乘胜追击，与仍停留在河对岸的波斯骑兵主力战作一团。正当贴撒利骑兵不畏强敌拼死冲杀时，帕门尼奥带领马其顿方阵也渡过河同希腊雇佣军正面交锋。不过，马其顿方阵因河岸地势不利，出现了不少士兵落伍的情况，同时，他们与右侧的联防部队也脱离开来。希腊雇佣军立即发现了这一良机，蜂拥而下直扑马其顿方阵右侧缺口。面对手持短剑扑过来的希腊雇佣军，马其顿重装步兵不得不舍弃长矛，以短剑与敌人展开肉搏战。希腊雇佣军不会忘记格拉尼库斯河一战中亚历山大的残忍，所以他们殊死搏杀；再加上加尔达刻步兵协同作战，马其顿方阵损伤惨重，渐渐招架不住。
正在这紧要关头，希腊雇佣军左翼突然大乱，原来，马其顿的3000近卫步兵已杀将过来。此时，亚历山大正率领右翼部队左转直取大流士。大流士的近卫骑兵和一些波斯贵族拼死保护皇帝，双方将士的尸体密布于大流士的黄金战车周围。大流士眼看有被俘的危险，紧急关头，他甩掉王袍，跃上一匹战马，在亲信及近卫军的保护下仓皇逃走。大流士此举，立即导致波斯大军全线崩溃，除希腊雇佣军有序撤退外，波斯士兵逃亡时慌不择路以致互相践踏，大量伤亡。
伊苏斯会战的胜利，让亚历山大具备了彻底战胜大流士的信心，同时也为马其顿远征军开启了通往波斯腹地的大门。通过这道门，当亚历山大一路向东攻城略地时，他的身份地位将超越马其顿国王和希腊同盟盟主。不过，亚历山大认为当务之急是必须南下尽快将波斯在爱琴海的海上基地占领。这样，波斯帝国再不能从海上侵犯希腊和马其顿，同时，他们也休想再与斯巴达联合威胁亚历山大国内基地的安全。
公元前332年8月，被围困七个月的提罗城被马其顿军队占领。亚历山大紧接着率军攻下叙利亚重要港口城市加沙，然后经过两个月的围困，拿下埃及。在埃及的孟斐斯，亚历山大加冕成为埃及法老王，并被称为“阿蒙神之子”。之后，他在北部沿地中海处建立亚历山大城。建城期间，他穿过利比亚的茫茫沙漠，到阿蒙神殿祭拜并求取神谕。当神谕告知杀害腓力二世的凶手已全部伏法，他将会成为全世界的主人时，亚历山大不禁信心倍增。为显示他在埃及的威严，亚历山大废除波斯在埃及实行的总督制，颁布新的行政体制，任命一位埃及人管理行政。
至此，亚历山大完全占有了波斯军队在爱琴海和地中海的海上控制权，他可以集中兵力与大流士决战了。
