多莉羊的问世举世瞩目,这意味着人类有可能用体细胞核移植技术快速、大量地克隆出优质饲养动物,其潜在的产业和商品价值是十分巨大的。但一般认为它的出现在近期对畜牧业生产量不会起到显著促进作用。由于草地的过度放牧和退化,造成饲料严重不足,加上农作物秸秆有效利用尚不尽如人意,自从世界牛羊肉生产量1990年达到6 200万吨后,近些年不仅不见提高,反而时有下降。可以说,新的绿色革命中畜牧业如何发展亦是焦点之一。
目前专家认为:进一步完善人工授精技术使公畜的繁殖潜力得到最大限度的发挥,胚胎移植和胚胎分割技术的发展可极大地提高母畜繁殖的潜力,两者有效结合,将使良种的繁殖能力产生革命性变革。
随着核移植技术的不断完善,尤其是体细胞核移植技术的日趋成熟,家畜育种中会出现一次以无性繁殖(克隆)代替有性繁殖的新的技术革命,从而使畜牧业生产出现前所未有的新局面。有用动物基因的不断被克隆和对动物转基因技术的成功运用,将为农业生物的定向的、有用的改良开辟一条理想的途径,会创造出能满足人类多方面需要的新物种、新品种乃至“超极动物”来。
动物的体外受精
体外受精就是将从母体采收出的卵子与经获能后的精子在体外条件下完成受精过程而形成胚胎的生物工程技术。它包括有卵母细胞的培养、精子获能处理、卵母细胞的受精、早期胚胎的培养及移植等一系列程序。
早在1878年,澳大利亚科学家Schenk曾用兔子作过体外受精试验,但未获得成功。1951年,张明觉和Austin确定了精子在授精前必须经过获能才能与卵子结合,使体外受精技术有了突破性进展。1956年,Whitten在胚胎培养液中加入牛血清白蛋白,使细胞期胚胎可以发育到胚泡期,为移植体外受精发育的胚胎奠定了基础。1959年,张明觉首次获得了世界上第一批体外受精小兔。于是人们将经体外受精出生的动物称为“试管动物”。
20世纪80年代,中国开始研究体外受精,虽然起步较晚,但发展速度很快。1986年,江苏省农业科学院范必勤获得体外受精仔兔。1989年,内蒙古大学旭日干获得试管绵羊羔和试管小牛。1990年,范必勤又获得了8只试管小猪。
80年代后期,随着胚胎工程、细胞工程和基因工程技术的快速发展,对哺乳动物的受精卵及胚胎的需要量迅速增长,仅依靠超数排卵技术来获得卵子已远远满足不了研究和生产的需求,因此除了实验动物及野生动物外,已开始从屠宰场收集废弃的家畜卵巢中未成熟的卵母细胞,经体外培养成熟后,应用体外受精来获得大量受精卵及不同日龄的胚胎。卵母细胞在体外培养成熟过程中,因物种、卵母细胞类型、培养液和是否加入血清、激素以及培养温度和气象条件等不同,而影响着培养卵母细胞的成熟率和受精率。
近20年来,科学家们虽然对20多种哺乳动物的卵母细胞进行体外受精的研究已经获得成功,但经体外培养成熟的卵母细胞体外受精率及受精后的发育率还很低。虽然已有12种动物的体外受精后代产生,但其妊娠产仔率还很低。目前,人类对卵母细胞的体外发育和成熟的研究尚不深入,今后将会对此方面给予高度的重视。
受精卵的体外培养已在牛、绵羊、猪、山羊等方面获得成功,但和再移入输卵管内的体内培养相比较,其成功率还很低。体外培养受精卵所用的培养液和卵细胞成熟所用的培养液基本相同,培养效果不佳,早期胚胎在培养过程中往往发生停滞现象。为此,许多研究者改用共同培养技术和在培养液中添加辅助成分的方法。
综上所述,随着卵母细胞的体外成熟培养、体外受精和早期胚胎培养、胚胎移植等技术的发展,有的国家已经成立了经营胚胎的公司,将由屠宰场收集的卵巢应用于体外受精技术,以工厂化形式大批量生产胚胎,开辟了丰富的胚胎资源,大幅度地降低了生产成本。在中国内蒙古已初步形成了绵羊胚胎生产线。野生的、珍奇的动物以及经济动物也会尽快地用体外受精技术进行繁殖后代和种质保存。
家畜胚胎工程
胚胎工程是对已经形成的动物胚胎施加种种人为的操作,然后使其继续发育,进而获得成体动物,并应用这种技术进行基础的和应用方面的研究。在动物胚胎移植技术迅速改进的同时,胚胎工程的研究范围越来越广,而胚胎工程的发展又大大推动了胚胎移植技术的应用,从而产生重要的理论意义和经济效益。
胚胎冷冻保存
在人工授精技术中,由于冷冻精液的研制成功,使得人工授精技术得到迅速的发展。可以预料,胚胎移植技术的推广应用,在相当程度上有赖于胚胎冷冻保存技术的发展。胚胎冷冻,就是将采取的新鲜胚胎或分割的半胚在超低温(-196℃)下储存备用。胚胎冷冻技术能够使胚胎长期保存,可以随时为母畜移植,而没有必要利用新鲜胚胎立即作移植;同时也不需要专门对受体母畜群作同期发情处理,使选择受体和移植胚胎的时间更加灵活;冷冻保存的胚胎可远距离运输,使得国际间的胚胎贸易变得更加方便;胚胎冷冻还可以用来保存一些濒临灭种的优良品种和品系。
1973年,英国剑桥大学首先以冷冻胚胎获得了小牛。
1980年,中国农业科学院畜牧所冷冻绵羊胚胎成功。1982年,上海奶牛研究所应用冷冻胚胎获得两头小牛。1987年,西北农业大学又获得山羊冷冻胚胎。
胚胎分割
动物的早期胚胎,如果因某种原因卵裂球相互脱离,但脱离了的卵裂球仍各具有发育成为新个体的能力,这种情况在自然界也偶有发生,称为“一卵双生”。胚胎分割就是用显微外科手术方法将一个胚胎内的卵裂球分离,造成一卵双生或一卵多生。这些个体后代的遗传性不但完全一样,性别也相同,可以形成一个无性繁殖系。对于分割后的半胚,可以移植一枚,冷冻储存一枚,待证明是优秀个体再将冷冻半胚加以利用。日本崔努达等(1974)首次将胚胎分割技术应用于家畜胚胎的研究,获得2只半胚绵羊羔;继而生出半胚同卵双生犊牛(1974)、1/4胚的羔羊(1981)以及1/5胚的羔羊(1983)。
1984年2月,日本科学家将一个牛胚胎分割后发育成两个胚胎的同卵半胚移植给两头母牛,均获得成功;其中有一个胚胎是在没有透明带包被的情况下移植的,推翻了胚胎必须有透明带才能移植成功的结论。西北农业大学张涌等(1987)沿对称轴分割山羊附植前夕的孵化增大胚泡,也用不装入透明带的分割半胚获得同卵双生山羊。
胚胎融合
胚胎融合又称“嵌合体”或“细胞杂交”。通过人工方法把具有不同遗传性状的种或品种的胚胎,或者把具有某种遗传特征的细胞和胚胎组合在一起,使之发育成为一个正常的个体。也可以在一定条件下将不同种类的细胞重叠在一起,使它们的原生质互相融合,从而使不同个体的遗传性互相结合,导致染色体组和细胞质的添加。胚胎融合技术不仅为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段,也为进一步控制动物繁殖显示出广阔的前景。现已证明,胚胎融合可以形成新品种和种间嵌合体后代,具有高度的杂种优势,能极大地缩短家畜改良时间,加快优良品种世代繁殖的步伐。
20世纪70年代以来,在绵羊、山羊、牛、小鼠和大鼠均获得品种间嵌合体后代。在小鼠和大鼠、绵羊和山羊、黄牛和瘤牛等动物获得了种间嵌合体后代。中国科学院生物研究所用昆明种白鼠和Cs7黑鼠做成的嵌合体,成功地培育出小鼠嵌合体。胚胎融合方法将为克服种间繁殖障碍提供十分重要的研究途径。
卵裂球核移植
家畜如牛、羊(我国湖羊例外)为单胎动物,一胎产一仔。由于家畜的繁殖都是通过精子和卵子结合的有性繁殖过程完成的,因此所产生的后代,个体之间存在着很大的差异。如“兄弟”、“兄妹”、“姊妹”、“姊弟”之间,虽是同父同母所生,但除一卵双胎外,都没有一样的。
科学家研究哺乳动物包括家畜的无性繁殖,目的就是要大量生产遗传上相同的良种动物。在畜牧业上总是希望能够获得肉奶稳产、高产、优质的家畜和肉蛋稳产、高产、优质的家禽。
为此,科学家建立了细胞核移植技术,可以从一个胚胎得到较多的遗传上相同的后代。
卵裂球核移植实际为细胞核移植,就是将优良母畜的胚胎卵裂球进行分离,获得几十个具有优良遗传基因的卵裂球细胞,然后将这些卵核分别注入一般去核的受精卵中,产生出许多遗传素质相同的后代。其目的是由一个优良胚胎产生出更多的优良后代,进一步提高优良母畜的繁殖潜力。美国曾以去掉受精卵中雄原核的方法获得7只单亲小鼠,去掉雄原核后,雌原核内的染色体经过复制,形成两个原核的卵细胞,又经培养,两个核融合在一起,于是卵细胞就开始分裂和发育,这些小鼠完全是纯合体。用这种方法产生的小鼠称为“亚无性繁殖”动物。1981年,美国和瑞士科学家采用核移植法成功地完成了小鼠的无性繁殖实验,生产出3只真正的无性繁殖小鼠。怎样进行细胞核移植呢?以两种不同毛色的兔子为例:
当白毛兔的受精卵发育成8个细胞期的胚胎时,用酶处理胚胎,胚胎的细胞便分散为8个细胞。这些细胞,叫供体核。
另外取黑毛兔的卵子作为接受供体核的细胞,叫受体细胞。在接受供体核之前,要先把受体细胞的核吸走,成为无核的受体细胞。把8个供体核,通过显微镜注射到8个受体细胞内,得到8个重构胚胎。把重构胚胎移植到另一只黑毛兔的子宫里,妊娠期满,小兔出生了,这些小兔长了一身白毛,是提供体细胞兔的毛色。
科学家用细胞核移植技术,获得了核移植的小鼠、兔、绵羊、山羊、猪和牛等动物。还曾从一个牛胚胎得到7头小牛。
通过这种核移植繁殖的动物,又叫克隆动物。
为了获得更多的克隆动物,科学家又创造了连续核移植方法。把第一次的构建胚胎,当其发育到64个细胞时期时,再用酶处理使细胞分散,作为供体核,进行第二次的细胞核移植,得到第二代的重构胚胎,再移植得到第二代核移植后代。
也可以进行第三次核移植,如此不断进行下去,从一个胚胎就可以得到无数的后代了。
当前,已获得第二代核移植的山羊和第三代核移植的牛。
从理论上讲,连续核移植可以得到无限的克隆动物。若首次用一个32个细胞期的胚胎细胞作为供体核,每次核移植,可获得5 000个克隆胚胎。当然要实现这个目标,尚须克服许许多多的困难。
胚胎性别鉴定
胚胎性别鉴定,就是在胚胎移植之前或通过分割下来的胚胎细胞进行性别鉴定,以控制下一代的性别。目的是为了预先决定让母畜生出公的或母的仔畜,或者使母牛只怀同性双胎,以避免产生异性孪生牛犊。
胚胎性别鉴定与胚胎冷冻技术相结合的实验虽然已获成功,但移植妊娠率尚低,有待进一步研究和提高。不少专家认为,胚胎性别鉴定与核移植以及其他生物技术相结合,将具有更大的实用价值和意义。
基因导入
基因导入就是给胚胎或细胞注入外源性基因,增加新的遗传物质,以达到快速改进家畜基因组型的遗传工程技术。1981年,美国托马斯等获得一种兔子β血球蛋白遗传物质——DNA。他从交配后不久的母鼠输卵管内将正处于受精过程的卵子取出来,将兔子的遗传基因(β血球蛋白)注射到刚进入卵子的精子体内。此时卵细胞已被精子激活,易于和异体DNA结合。他们用这种方法获得了5个子鼠,其体内血液细胞中含有兔子血液蛋白质,这5个子鼠的后代仍含有兔子的基因。这样,他们不仅将兔子的基因成功地移植到鼠体内,并能使基因遗传给后代。1982年,美国把大鼠的生长素基因注入小鼠原核期卵内,并生产出能由肝脏表达生长素基因的“超级小鼠”。科学家希望它将成为探索重要生命现象的奥秘、制造激素纯品和新型实验动物、治疗遗传疾病以及产生“超级家畜”的有力手段。一旦能够比较稳定地获得基因转移家畜,将会给畜牧业带来无法估计的经济效益,但尚有很多技术性问题需要研究解决。
胚胎移植
哺乳动物卵子是在体内受精、体内发育的。将受精卵或早期胚胎从一头供体母畜的输卵管或子宫内取出来,然后移植到另一头或几头受体母畜的相应部位,使之发育产仔,这种新技术称受精卵移植或胚胎移植,也叫“借腹怀胎”。胚胎移植可以提高良种母畜的繁殖率,加快育种工作的进行。胚胎移植的基本环节包括胚胎的采集、鉴别、保存和移植。为使这项技术更富有实用价值,其范围还包括供体母畜的超数排卵和受体母畜的同期发情等内容。